Современные возможности технологии хемилюминесцентного анализа в хирургии

 

История изучения хемилюминесценции (ХЛ) биологических объектов насчитывает около пяти десятилетий с тех пор, как итальянские астрономы Л.Колли и У.Фаччини обнаружили свечение непигментированных тканей растений. Если в первых работах интерес к ХЛ был связан, в основном, с поисками принципиальных доказательств образования возбужденных и свободнорадикальных состояний в темновых биологических реакциях, то сейчас ХЛ является по существу обычным лабораторным методом, широко используемым в клинике. Успехи в этой области во многом связаны с совершенствованием техники регистрации слабых световых потоков, позволяющей улавливать излучение отдельных клеток и получать микроскопическое изображение свечения [11, 17].

 

На сегодняшний день химические и физические явления, лежащие в основе превращения энергии биохимических реакций в световое излучение, в основном расшифрованы. Хемилюминесцентная реакция включает следующие основные стадии: а) восстановление одного из участников реакции и окисление второго, приводящее к накоплению химической энергии в системе; б) перенос электрона на один из более высоких энергетических уровней и образование, таким образом, продукта реакции в электронно-возбужденном состоянии; в) высвечивание фотона при переходе молекулы из электронно-возбужденного в основное состояние (люминесценция) [2, 3, 19]. Разнообразие реальных механизмов хемилюминесцентных реакций определяется природой и энергетикой отдельных стадий, структурой реагентов, большим числом промежуточных и конечных продуктов.

 

Сверхслабое свечение или собственное излучение клеток и тканей практически всегда сопровождает процессы жизнедеятельности и может быть обусловлено тремя типами реакций: реакциями активных форм кислорода (АФК), реакциями цепного (перекисного) окисления липидов, реакциями с участием оксида азота [22]. Главным источником АФК в организме человека и животных служат клетки-фагоциты: гранулоциты, моноциты крови и тканевые макрофаги. Непосредственной причиной собственной хемилюминесценции активированных фагоцитов считают образование синглетного кислорода в реакциях между кислородными радикалами, перекисью водорода и гипохлоритом.

 

Одной из основных составляющих собственной (неактивированной) хемилюминесценции животных клеток и тканей является свечение, сопровождающее цепное окисление липидов в мембранных структурах клеток и липопротеинах крови. В реакции взаимодействия двух радикалов липопероксида образуются молекулы кетона и кислорода в электронно-возбужденном состоянии, которые затем переходят в основное состояние, испуская квант света (фотон). Увеличение продукции радикалов в системе сопровождается ростом интенсивности ХЛ. Вещества-антиоксиданты, реагирующие со свободными радикалами и тормозящие цепное окисление, одновременно подавляют хемилюминесценцию. При этом подавление собственной хемилюминесценции тканей и клеток антиоксидантами, например токоферолом, указывает на то, что это свечение обусловлено реакциями цепного окисления липидов. С другой стороны, изучая влияние различных природных и синтетических соединений на кинетику ХЛ, можно получать представление о способности этих веществ препятствовать повреждающему действию свободных радикалов [5, 12, 22].

 

Окисид азота выделяется многими типами клеток и является одним из основных регуляторов внутриклеточных процессов. Участие реакций нитроксида в собственной хемилюминесценции тканей животных было показано в опытах Джулио Терренса и сотрудников, которые изучали свечение перфузируемого легкого. Авторы регистрировали существенное снижение свечения при введении в перфузат нитро-L-аргинина, ингибитора NO-синтазы. Установлено, что источником ХЛ является реакция пероксинитрита - токсичного продукта взаимодействия окиси азота и супероксида, - с белком. Природа процессов, определяющих собственное свечение ткани, может меняться при изменении ее состояния. В опытах того же автора было показано, что у животных с пневмонией ингибитор NO-синтазы слабо влиял на свечение органа, в то время как супероксиддисмутаза и ловушки липидных радикалов вызывали существенное уменьшение интенсивности свечения. Это позволило предположить, что при воспалении на первый план выходят реакции, связанные с активацией клеток-фагоцитов и образованием ими активных форм кислорода, а затем - липидных перекисей, тогда как в норме за свечение ответственны реакции окиси азота.

 

Собственная хемилюминесценция, сопровождающая биохимические реакции в клетках и тканях, отличается низкой интенсивностью, что явилось основным препятствием на пути к широкому ее использованию в аналитических целях. Значительное распространение получило измерение хемилюминесценции в присутствии активаторов (индукторов). Химическими активаторами (зондами ХЛ) называют соединения, вступающие в реакции с активными формами кислорода или органическими свободными радикалами, в ходе которых образуются молекулы продуктов в возбужденном электронном состоянии. Наблюдаемое при этом свечение связано с переходом молекул в основное состояние, что приводит к высвечиванию фотонов. Известными представителями группы химических активаторов являются люминол (3-аминофталевый гидразид) и люцигенин [Бис(N-метилакридиний)] [2, 5].

 

Физические активаторы не вступают в химические реакции и не влияют на ход реакций, сопровождающихся свечением, но, тем не менее, многократно усиливают интенсивность хемилюминесценции. К ним относятся некоторые люминесцирующие соединения, усиливающие ХЛ при цепном окислении липидов, в том числе родамин Ж, ализариновый красный, конго красный, фуксин кислый, метиленовый голубой, акридиновый оранжевый, некоторые порфирины и редкоземельные металлы. Поиск веществ-активаторов, не оказывающих влияния на ход реакций перекисного окисления, но многократно увеличивающих интенсивность свечения, продолжается в настоящее время.

 

В широкой клинической практике хемилюминесцентный анализ используется в трех основных вариантах: ХЛ сыворотки крови и других биологических жидкостей, клеточная ХЛ и хемилюминесцентный иммунный анализ.

 

Индуцированная ХЛ сыворотки крови, по мнению большинства исследователей, является наиболее чувствительным и объективным методом изучения процесса перекисного окисления липидов. Реакции цепного окисления отличаются большой сложностью и включают в себя целый ряд быстропротекающих стадий. Основные участники реакций, свободные радикалы, обычными методами химического анализа определены быть не могут из-за своей крайне высокой реакционной способности и неустойчивости в биохимических системах. Поэтому регистрация интенсивности свечения в режиме реального времени представляет собой ценную информацию для анализа механизма реакций перекисного окисления липидов.

 

Уровень ХЛ сыворотки крови является отражением подвижного равновесия, объективным интегральным показателем соотношения интенсивности ПОЛ и активности биологических антиоксидантных систем организма. Регистрация ХЛ тканей и биологических жидкостей лежит в основе многообразия методов выявления ранних стадий нарушения защитно-приспособительных реакций организма, диагностики состояния предболезни, определения прогноза и тяжести заболевания, выбора этиопатогенетического воздействия и контроля состояния пациента [1, 11, 15, 18].

Концентрация свободных радикалов в исследуемом объекте определяется по значению максимальной интенсивности сигнала (I max) и светосуммы (S). Антиоксидантный потенциал пробы коррелирует со скоростью падения кривой хемилюминесценции (tg a) и коэффициентом К, определяемым по соотношению I max/S. При острых воспалительных процессах наблюдается увеличение I max и S, при этом степень увеличения пропорциональна тяжести воспалительного процесса. Снижение значений указанных показателей более чем в два раза регистрируется при наличии злокачественных новообразований [5, 13].

 

Анализ кинетики хемилюминесцентных реакций различных биологических жидкостей (сыворотки крови, мочи, ликвора, слюны, раневого, плеврального и перитонеального экссудата) позволяет осуществлять дифференциальную диагностику неспецифического воспаления и онкологического процесса, функционального и органического поражения. Так, определение интенсивности ХЛ сыворотки крови лежит в основе экспресс-метода дифференциальной диагностики приступа абдоминальной формы периодической болезни и заболеваний, протекающих с картиной «острого живота», и позволяет уменьшить частоту необоснованных хирургических вмешательств [2, 11, 18].

 

Существенный интерес представляет изучение влияния на ХЛ разнообразных внешних агентов, обладающих как про-, так и антиоксидантным действием. В клинической практике способность антиоксидантов подавлять люцигенинзависимую хемилюминесценцию используется для оценки их количественного содержания в биологическом материале. С другой стороны, анализ интенсивности ХЛ является адекватным критерием эффективности и безопасности антиоксидантной и окислительной терапии [8, 9, 10, 16, 20]. Исследование ХЛ сыворотки крови позволило подтвердить, в частности, эффективность озонотерапии в компенсации свободнорадикального окисления [8, 9, 16, 17].

 

По мнению Е.В.Иванишкиной и соавт., наиболее информативным хемилюминесцентным показателем контроля эффективности микроволновой резонансной терапии в лечении язвенной болезни является суммарная антиоксидантная активность сыворотки крови. Изучение динамики ХЛ раневого экссудата у больных с длительно незаживающими ранами и трофическими язвами нижних конечностей позволяет прогнозировать скорость процесса репарации и оценить эффективность влияния различных средств местного лечения.

 

Под термином «клеточная хемилюминесценция» понимают все виды свечения, сопровождающие химические реакции в живых клетках, в том числе биолюминесценцию - свечение, обусловленное определенными ферментативными реакциями и видимое простым глазом; «митогенетическое излучение» - свечение в ультрафиолетовой области спектра, оказывающее воздействие на другие клетки; а также все виды «сверхслабого свечения». Широкое применение в клинической практике нашел метод оценки перекисной резистентности эритроцитов, основанный на регистрации индуцированной ХЛ эритроцитов и отражающий интенсивность ПОЛ на мембране клеток [8].

 

В последнее время, однако, термин «клеточная ХЛ» чаще употребляется в более узком смысле: так называют свечение, сопровождающее продукцию активных форм кислорода клетками-фагоцитами. В основе этого типа клеточной ХЛ лежит образование супероксидного анион-радикала в результате одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода ферментной системой НАДФН-оксидазой. Дальнейшие превращения этого первичного радикала сопровождаются хемилюминесценцией. Высокая чувствительность данного метода, абсолютная безвредность по сравнению с радиоиммунологическим анализом, а также большой научный интерес к деятельности клеток-фагоцитов привели к тому, что число публикаций по данному вопросу ежегодно исчисляется тысячами, а сфера применения метода постоянно растет. ХЛ анализ позволяет исследовать механизмы активации фагоцитов (полиморфноядерных лейкоцитов, тканевых макрофагов), оценить иммунореактивность организма под влиянием иммунодепрессивных и стимулирующих воздействий, выявить недостаточность опсонических факторов сыворотки, в том числе индуцирующихся при активации альтернативного пути комплемента, специфических антител.

 

В качестве объектов фагоцитоза при изучении стимулированной ХЛ используют различные неопсонизированные и опсонизированные частицы (латекс, зимозан, бактерии), иммунные комплексы, ионофоры, промоторы опухолей, фрагменты С5-компонента комплемента, арахидоновую кислоту и другие. Функциональный ответ лейкоцитов на воздействие стимулов in vitro является специфическим в зависимости от вводимого антигена и метаболического состояния клеток, что позволяет с одной стороны установить возбудителя при ряде инфекционных заболеваний, с другой - оценить величину метаболического резерва лейкоцитов [3, 6, 7, 14].

 

Метод регистрации ХЛ клеток крови позволяет проводить изучение и отбор иммуномодулирующих фармакологических препаратов на основании сравнения люминолзависимой стимулированной хемилюминесценции до и после введения в пробу с лейкоцитарной взвесью исследуемых препаратов.

 

Хемилюминесцентный тест является высокочувствительным и безопасным методом диагностики непереносимости лекарственных средств. В случае непереносимости инкубация цельной крови с раствором этих препаратов в терапевтических концентрациях сопровождается достоверным снижением генерации активных форм кислорода нейтрофилами, стимулированными неспецифическими активаторами. Снижение люминолзависимой хемилюминесценции цельной крови при непереносимости лекарственного препарата отмечается независимо от химических свойств и принадлежности медикаментов к фармакологическим группам.

 

Возможности хемилюминометрии значительно расширились после разработки ее модификаций, основанных на хемилюминесцентном иммунном анализе. Для определения содержания в средах организма антигенов, антител и биологически активных веществ используется связывание одного из реагентов с хемилюминесцентной меткой, изменяющей энергетическое состояние во время иммунологической реакции антиген-антитело. Хемилюминесцентной меткой чаще всего служат низкомолекулярные соединения, по химической структуре близкие люминолу и люцигенину, такие как изолюминол, сукцинилированный люминол, эфиры акридиния и другие. Присоединение метки производится либо к антигену, т.е. низкомолекулярному соединению (хемилюминесцентный иммунный анализ), либо к антителу на этот антиген (иммунохемилюминометрический анализ). Оба метода направлены на экспресс-определение биологически активных низкомолекулярных соединений (гормонов, антител, лимфокинов и др.) в сверхнизких концентрациях [7, 24].

 

В заключении необходимо отметить, что анализ данных литературы демонстрирует большие возможности применения хемилюминесцентного анализа в клинико-биохимических лабораториях для целей медицинской диагностики. К перспективам использования метода можно отнести расширение круга изучаемых заболеваний, уточнение патогенеза болезней и прогнозирование их исхода, динамическое наблюдение за эффективностью терапии, определение новых направлений лечебно-профилактического воздействия.

 

Список литературы:

1. Авзалетдинова, А.Р. Хемилюминесценция крови и мочи у больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом /А.Р. Авзалетдинова, Р.Р. Фархутдинов, Р.М. Фазлыева // Здравоохранение Башкортостана.- 1994.- №4.- С. 36- 39.

2. Владимиров, Ю.А. Свободные радикалы и антиоксиданты / Ю.А. Владимиров // Вестн. РАМН. - 1998. -№7. -С.43-51.

3. Дамбаева, С.В. Оценка продукции активных форм кислорода методом лазерной проточной цитометрии в клетках периферической крови человека / С.В. Дамбаева, Д.В. Мазуров, Б.Г. Пинегин // Иммунология.- 2001.- №6.- С.58- 60.

4. Демин, Д.Б. Прогностическое значение содержания продуктов липопероксидации в тканях при панкреонекрозе / Д.Б. Демин, В.С. Тарасенко, Д.В. Волков // Вестник хирургии.- 2003.- Том 162.- №5.-С. 47-50.

5. Добротина, Н.А. Хемилюминесценция в оценке гомеостаза человека / Н.А. Добротина, Г.П. Ежова // - Н/Новгород, 1991. - С.104.

6. Друх, В.М. Метод изучения хемилюминесценции лейкоцитов цельной крови / В.М. Друх // Клин. лаб. диагностика.- 2004.- №12.- С.41.

7. Кондрашова, Е.А. Хемилюминесценция как наиболее чувствительный метод иммуноферментного анализа и его применение / Е.А. Кондрашова, М.Г. Кожанов// Клиническая лабораторная диагностика.- 1999.- №9.- С.32.

8. Конторщикова, К.Н. Перекисная резистентность мембран эритроцитов у больных ИБС в процессе озонотерапии / К.Н. Конторщикова // Клин. лаб. диагностика - 2004.-№9.-С.52.

9. Коррекция гомеостаза при остром панкреатите методом озонотерапии / М.И. Гульман, Ю.С. Винник, С.В. Миллер и др.//- Красноярск, 2003.-С.179.

10. Кузнецов, Н.А. Результаты применения синтетических антиоксидантов в лечении больных деструктивным панкреатитом / Н.А. Кузнецов, Г.В. Родоман // Хирургия.-2005.-№3.- С.36-39.

11. Любимов, Г.Ю. Хемилюминесцентный анализ / Г.Ю. Любимов // Иммунология.- 1991.- №1.- С.40 -49.

12. Меньшикова, Е.Б. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов / Е.Б. Меньшикова, Н.К. Зенков // Успехи современной биологии.- 1993.- №4.- С. 422- 455.

13. Меньшикова, Е.Б. Окислительный стресс при воспалении / Е.Б. Меньшикова, Н.К. Зенков // Успехи современной биологии.- 1997.- №2.- С. 155- 171.

14. Митерева, Д.Е. Модификация метода хемилюминесцентного анализа для оценки активности фагоцитов цельной крови сенсибилизированных животных / Д.Е Митерева // Клин. лаб. диагностика - 2004.- №9.-С.9.

15. Островский, В.К. Оценка тяжести и прогноз гнойно-деструктивных заболеваний органов брюшной полости / В.К. Островский, А.В. Мащенко // Хирургия.- 2007.- №1.- С.33.37.

16. Перетягин, С.П. Механизмы лечебного действия озона при гипоксии / С.П. Перетягин // Озон в биологии и медицине: Тез. докл 1 Всеросс. науч.-практ. конф. - Н/Новгород, 1992. -С.4-5.

17. Стежко, Д.В. Новая хемилюминесцентная технология и прибор определения воздействия озона во время проведения сеансов озонотерапии / Д.В. Стежко // Новая технология: Научн. техн. сборник.- 2003.- №1.- С. 21-24.

18. Терехина, Н.А. Хемилюминесцентный анализ биологических жидкостей больных сахарным диабетом / Н.А. Терехина // Клин. лаб. диагностика.- 2004.- №10.- С.20.

19. Теселкин, Ю.О. Определение антиоксидантной активности плазмы крови с помощью системы НЬ-Н2О2-люминол / Ю.О. Теселкин, Ю.А. Владимиров // Вопросы медицинской химии. -1998.- №3.

20. Черданцев, Д.В. Диагностика и лечение окислительного стресса при остром панкреатите / Д.В. Черданцев, Ю.С. Винник, Э.В. Каспаров // - Красноярск, 2002.-С.148.

21. Betteridge D.J. What is oxidative stress? / D.J. Betteridge // Metabolism - 2000. -Vol. 49. - Suppl. 1. - P. 3-8.

22. Gutteridge J.M. Free radicals and antioxidants in the year 2000. A historical look to the future / J.M. Gutteridge, В. Halliwell // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 2000. - Vol. 899. - P. 136-147.

23. Protein carbonyl measurements show evidence of early oxidative stress in critically ill patients / С.С. Winterbourn, Н.Н. Buss, Т.Р. Chan et al.// Crit. Care Med. - 2000. - Vol. 28. - P. 143-149.

24. Roda A Compiled Reactions for the Determination of Enzymes Based on the Use of Lu­minescence / А. Roda, С. Carrea, S. Cirotti // Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence. -1999.-4.-P.423-435